プレートデータから標準曲線をフィッティングし、未知試料を補間する方法

このガイドでは、BioRender Graphingでdose-response標準曲線をフィッティングし、プレートリーダーのエクスポートデータのように、標準試料と未知試料が同じデータ列にある場合に、それを使用して未知試料を補間する方法を説明します。また、補間した値をグラフ化する方法も説明します。

注: Graphingエージェントは現在、標準曲線の補間をサポートしていません。未知試料を補間するには、このガイドの手順を手動で実行してください。

ステップ1: データをアップロードする

新しいGraphingファイルを開き、Choose a file (1)をクリックするか、ファイルをドラッグして追加します。対応形式は.csv、.xlsx、.xls、.prism、.pzfxで、最大50MBです。

ステップ2: インポートするデータセットを選択する

ワークブックに複数のデータセットが含まれている場合は、必要なデータセットにチェックを入れ(1)、Import data (2)をクリックします。

ステップ3: データレイアウトを確認する

この例のデータセットは、BioRender Graphingで利用できるELISA薬剤スクリーニングのサンプルデータに似ており、プレートリーダーからのロング形式の出力として配置されています。標準試料にはconc_std (1)に既知の濃度があります。未知試料には、同じvalue列に応答値と、処理ラベル(2)のみがあります。

ステップ4: 標準試料のOD値の変数を作成する

1. Variablesパネルで+をクリックして変数を追加します。たとえばODval_std という名前を付けます
2. Select cellsをクリックします。
3. "Save"をクリックします。

ステップ5: 標準試料のセルを選択する

1. 標準試料の応答セル上をドラッグします。 
2. 範囲がボックスに表示されます(この例ではC2:C25)。
3. "Done"をクリックします。
4. "Save"をクリックします。

ステップ6: 未知ウェルのOD値の変数を作成する

1. 2つ目の変数を追加します(たとえばODval_unk)。 
2. 未知試料の範囲を指定します(例: C26:C97)。
3. "Save"をクリックします。

ステップ7: 両方の変数を確認する

ODval_stdとODval_unkが「Variables」パネル(1)に表示されます。

ステップ8: 新しいグラフを作成する

Graphsで「Create new」(1)をクリックします。

ステップ9: Dose response curveを選択する

Graph typeリストを開き、「Dose response curve」(1)を選択します。

ステップ10: 変数を割り当てる

1. X軸変数を濃度conc_stdに設定します。
2. Y軸変数を標準試料の応答値ODval_stdに設定します。 
3. 次に"Continue"をクリックします。

ステップ11 (任意): X軸を対数軸にする

1. X軸をクリックします
2. 「Axis scale」をLog10に設定します 
3. または、"Quick edit"に下軸を底10の対数に設定するよう依頼します。

ステップ12: 新しい解析をRunする

左パネルでRun new analysis (1)をクリックします。

ステップ13: regressionを選択する

1. Analysis typeをNonlinear Regressionに、Regression Typeを「Dose-Response Regression」に設定します。 
2. Dose response modelで、応答が用量とともに増加する場合は「Stimulation」を、減少する場合は「Inhibition」を選択します。

ステップ14: 補間オプションを表示する

Step 3 - Follow-up analysesまでスクロールし、Show interpolation options (1)をクリックします。

ステップ15: 未知試料を選択する

1. Values to interpolateを開きます。
2. 未知試料を含む変数を選択します。

ステップ16: 方向を選択して実行する

1. 変数を確認します。 
2. Interpolation directionで、応答値から濃度を取得するにはFind X from Yを選択します。
3. または、既知の濃度から応答値を予測するにはFind Y from Xを選択します。 
4. 「Follow-up analyses」でInterpolationにチェックが入ります。
5. "Run analysis"をクリックします。

ステップ17: フィッティングした曲線を表示する

• 各解析はReports (3)に保存されます。  
• Show analysis (1)で、実行したばかりのDose-Response Regressionを選択すると、フィッティングした曲線がグラフに表示されます。 
• 必要に応じて、Best-fit curve、95% Confidence intervalなどを切り替えます(2)。 

ステップ18: レポートを開く

1. ReportsのDose Response Regressionレポートをクリックします。最適フィット値(EC50)、曲線係数(Top、Bottom、Hill slope)、および適合度が一覧表示されます。 
2. その後に、未知試料の補間値が表示されます。

ステップ19: 補間値を読み取る

1. Inputは測定値、Predictedは補間値で、95% CIとともに表示されます。 
2. 「Within 2% of a plateau」は、結果の決定精度が低いことを意味します。 
3. 「No result can be calculated for this value」というメッセージとともにNAと表示される場合は、入力値が曲線のTopとBottomの範囲外にあります(3)。 
4. Add as new datasetをクリックすると、この表を以降の解析用のデータセットとして扱えます。

ステップ20: 新しいデータセットを開く

1. 補間値を含む新しいタブがデータビューの下部に表示されます。元のデータにある未知試料の処理ラベルをコピーして、このデータセットのSample見出しの下に貼り付けると、関連するラベルを付けることができます。 
2. 次に「Detect variables」をクリックして、各列に変数を割り当てます。

ステップ21: 検出された変数を確認する

Sample、Input、Predicted、95% CI、Notesが変数になっています。

ステップ22: 補間値をGraph化する

新しいグラフを作成します。 

1. 補間されたデータセットを選択します。
2. Mean/median lineなどのグラフタイプを選択します。 
3. X軸変数をSampleに設定します。
4. Y軸変数をPredictedに設定します。
5. "Continue"をクリックします。

ステップ23 (任意): 信頼性の低い値を除外する

1. 「Within 2% of a plateau」とフラグが付いた192.19など、決定精度の低い値を削除するには、「Displayed」dataでその値を右クリックします。
2. 「Exclude」を選択します。

ステップ24: 更新されたグラフを確認する

1. Y軸のスケールが変更されます。
2. 値がグレー表示になります。

よくある問題のトラブルシューティング

「No result can be calculated for this value」というメッセージとともに結果が「NA」と表示される

入力値が、フィッティングされた標準曲線のTopを上回るか、Bottomを下回る場合に発生します。

たとえば、フィッティングされたTopが2.04、Bottomが0.08の曲線では、2.1または0.02の値は範囲外になります。

解決方法:

• 測定値が正しいことを確認します。
• 必要に応じて、標準曲線の範囲内の測定値が得られる希釈倍率で試料を再測定します。

結果が「Within 2% of a plateau」と表示される

標準曲線のTopまたはBottomに近い値は信頼性が低く、極端な結果や、広いまたは欠落した95%信頼区間(CI)が生じる場合があります。

解決方法:

• 可能な限り、標準曲線の傾きがより急な中央部分に入る試料を使用します。
• または、影響を受けた値を解析から除外します(ステップ23を参照)。

未知試料の変数が「Values to interpolate」に表示されない

conc_stdやODval_stdなど、すでにグラフ軸に割り当てられている変数は、「Values to interpolate」リストに表示されません。

解決方法:

• ステップ4～6に従って、未知試料を別の変数として作成します。
• 「Values to interpolate」に戻り、新しく作成した変数を選択します。

統計検定に「Category 'drug_2' has 1 samples, needs at least 2」と表示される

統計検定を実行するための有効な結果が、あるグループに十分ない場合に発生します。

たとえば、3つのdrug_2結果のうち2つがNAの場合、有効な値は1つしか残りません。

解決方法:

• グループ内のNA結果を確認します。
• グループの有効な値が2つ未満の場合は、統計検定を再度実行する前に「Select categorical groups」でそのグループの選択を解除します。

よくある質問

標準試料と未知試料に別々の変数を作成するのはなぜですか?

両方が同じvalue列に含まれているためです。別々の変数を作成することで、どのセルを曲線のフィッティングに使用し、どのセルを補間するかをGraphingに指定できます。

Find X from YとFind Y from Xはいつ使い分けますか?

測定した応答値から濃度を推定するにはFind X from Yを使用します。既知の濃度から応答値を予測するにはFind Y from Xを使用します。

どのdose responseモデルを選択すればよいですか?

ELISAキットでは通常、標準曲線のフィッティングに4PL dose-responseモデルを推奨しています。 標準曲線のOD値がすべて応答の直線範囲内にある場合は、上記と同様のワークフローを使用して、線形モデルから補間することも同様に妥当です。