プレートデータから標準曲線をフィッティングし、未知試料を補間する方法

このガイドでは、BioRender Graphingでdose-response標準曲線をフィッティングし、プレートリーダーからのエクスポートデータのように、標準試料と未知試料が同じデータ列にある場合に、これを使用して未知試料を補間する方法を説明します。また、補間した値をグラフ化する方法も説明します。

ステップごとのガイド

ステップ1：データをアップロードする

新しいGraphingファイルを開き、「ファイルを選択」（1）をクリックするか、ファイルをドラッグします。対応している形式は.csv、.xlsx、.xls、.prism、.pzfxで、最大50MBまでです。

ステップ2：インポートするデータセットを選択する

ワークブックに複数のデータセットが含まれている場合は、必要なもの（1）にチェックを入れ、「データをインポート」（2）をクリックします。

ステップ3：データのレイアウトを確認する

この例のデータセットは、BioRender Graphingで利用できるELISA薬剤スクリーニングのサンプルデータに似ており、プレートリーダーからのロング形式の出力として配置されています。標準試料にはconc_std（1）に既知の濃度があります。未知試料には、同じvalue列の応答と処理ラベル（2）のみがあります。

ステップ4：標準試料のOD値の変数を作成する

1. 「変数」パネルで「+」をクリックして変数を追加します。例として、ODval_std という名前を付けます。
2. 「セルを選択」をクリックします。
3. "Save"をクリックします。

ステップ5：標準試料のセルを選択する

1. 標準試料の応答セル上をドラッグします。 
2. 範囲がボックスに表示されます（この例ではC2:C25）。
3. "Done"をクリックします。
4. "Save"をクリックします。

ステップ6：未知ウェルのOD値の変数を作成する

1. 2つ目の変数を追加します（例：ODval_unk）。 
2. 未知試料の範囲を指定します（例：C26:C97）。
3. "Save"をクリックします。

ステップ7：両方の変数を確認する

ODval_stdとODval_unkが「変数」パネル（1）に表示されます。

ステップ8：新しいグラフを作成する

「グラフ」で「新規作成」（1）をクリックします。

ステップ9：Dose response curveを選択する

Graphタイプのリストを開き、「Dose response curve」（1）を選択します。

ステップ10：変数を割り当てる

1. X軸変数に濃度conc_stdを設定します。
2. Y軸変数に標準試料の応答ODval_stdを設定します。 
3. 次に"Continue"をクリックします。

ステップ11（任意）：対数X軸を使用する

1. X軸をクリックします。
2. 「軸のスケール」をLog10に設定します。 
3. または、"Quick edit"に依頼して、下側の軸を底10の対数に設定します。

ステップ12：新しい解析をRunする

左側のパネルで、新しい解析をRun（1）をクリックします。

ステップ13：regressionを選択する

1. 解析タイプをNonlinear Regressionに、回帰タイプを「Dose-Response Regression」に設定します。 
2. 「Dose response model」で、応答が用量とともに上昇する場合は「Stimulation」を、低下する場合は「Inhibition」を選択します。

ステップ14：補間オプションを表示する

「ステップ3 - 追加解析」までスクロールし、「補間オプションを表示」をクリックします（1）。

ステップ15：未知試料を選択する

1. 「補間する値」を開きます。
2. 未知試料を格納している変数を選択します。

ステップ16：方向を選択して実行する

1. 変数を確認します。 
2. 「補間の方向」で、「YからXを求める」を選択して、応答から濃度を取得します。
3. または、「XからYを求める」を選択して、濃度から応答を予測します。 
4. 「追加解析」で「補間」にチェックが入ります。
5. "Run analysis"をクリックします。

ステップ17：フィッティングされた曲線を表示する

• 各解析は「レポート」（3）に保存されます。  
• 「解析を表示」（1）で、実行したばかりのDose-Response Regressionを選択すると、フィッティングされた曲線がグラフに表示されます。 
• 必要に応じて、「ベストフィット曲線」、「95%信頼区間」などを切り替えます（2）。 

ステップ18：レポートを開く

1. 「レポート」の下にあるDose Response Regressionレポートをクリックします。ベストフィット値（EC50）、曲線係数（Top、Bottom、Hill slope）、適合度が一覧表示されます。 
2. 続いて、未知試料の補間値が表示されます。

ステップ19：補間値を読み取る

1. Inputは測定値、Predictedは補間値で、95% CIとともに表示されます。 
2. 「プラトーから2%以内」は、結果の確度が低いことを意味します。 
3. 「この値について結果を計算できません」というメッセージとともにNAと表示される場合は、入力値が曲線のTopとBottom（3）の範囲外にあります。 
4. 「新しいデータセットとして追加」をクリックして、この表を以後の解析用のデータセットとして扱います。

ステップ20：新しいデータセットを開く

1. 補間値を含む新しいタブがデータビューの下部に表示されます。元のデータにある未知試料の処理ラベルを、Sample見出しの下にこのデータセットへコピー＆ペーストすると、関連するラベルを引き継ぐことができます。 
2. 次に「変数を検出」をクリックして、各列に変数を割り当てます。

ステップ21：検出された変数を確認する

Sample、Input、Predicted、95% CI、Notesが変数になっています。

ステップ22：補間値をGraph化する

新しいグラフを作成します。 

1. 補間されたデータセットを選択します。
2. Mean/median lineなどのグラフタイプを選択します。 
3. X軸変数にSampleを設定します。
4. Y軸変数にPredictedを設定します。
5. "Continue"をクリックします。

ステップ23（任意）：信頼性の低い値を除外する

1. 「プラトーから2%以内」とフラグが付いた192.19など、確度の低い値を削除するには、「表示」データ内でその値を右クリックします。
2. 「除外」を選択します。

ステップ24：更新されたグラフを確認する

1. Y軸のスケールが変更されます。
2. 値がグレー表示になります。

よくある問題のトラブルシューティング

結果に「この値について結果を計算できません」というメッセージとともに「NA」と表示される

入力値が、フィッティングされた標準曲線のTopを上回るか、Bottomを下回る場合に発生します。

たとえば、フィッティングされたTopが2.04、Bottomが0.08の曲線では、2.1や0.02の値は曲線の範囲外になります。

解決するには：

• 測定値が正しいことを確認します。
• 必要に応じて、標準曲線の範囲内の測定値が得られる希釈倍率でサンプルを再測定します。

結果に「プラトーから2%以内」と表示される

標準曲線のTopまたはBottomに近い値は信頼性が低く、極端な結果や、広いまたは欠落した95%信頼区間（CI）が生じる場合があります。

解決するには：

• 可能な限り、標準曲線の傾きがより急な中央部分に入るサンプルを使用します。
• または、影響を受けた値を解析から除外します（ステップ23を参照）。

未知試料の変数が「補間する値」に表示されない

conc_stdやODval_stdなど、グラフ軸にすでに割り当てられている変数は、「補間する値」のリストに表示されません。

解決するには：

• ステップ4～6に従って、未知試料を別の変数として作成します。
• 「補間する値」に戻り、新しく作成した変数を選択します。

統計検定に「カテゴリ‘drug_2’には1個のサンプルがあります。少なくとも2個必要です」と表示される

検定を実行するための有効な結果がグループ内に十分にない場合に、このエラーが発生します。

たとえば、3つのdrug_2の結果のうち2つがNAの場合、有効な値は1つしか残りません。

解決するには：

• グループのNA結果を確認します。
• グループ内の有効な値が2つ未満の場合は、統計検定を再度実行する前に、「カテゴリグループを選択」でそのグループの選択を解除します。

よくある質問

なぜ標準試料と未知試料に別々の変数を作成するのですか？

両方が同じ値の列にあるためです。別々の変数にすることで、どのセルを曲線のフィッティングに使用し、どのセルを補間するかをGraphingに指定できます。

「YからXを求める」と「XからYを求める」はいつ使い分けますか？

測定した応答から濃度を推定する場合は「YからXを求める」を使用します。既知の濃度から応答を予測する場合は「XからYを求める」を使用します。

どの用量反応モデルを選択すればよいですか？

ELISAキットでは通常、標準曲線のフィッティングに4PL dose-responseモデルを推奨しています。標準曲線のOD値がすべて応答の線形範囲内にある場合は、上記と同様のワークフローで線形モデルから補間することも同様に妥当です。