Cómo ajustar una curva estándar e interpolar valores desconocidos a partir de datos de una placa

Esta guía muestra cómo ajustar una curva estándar de dose-response en BioRender Graphing y utilizarla para interpolar muestras desconocidas cuando los estándares y las muestras desconocidas se encuentran en la misma columna de datos, como en una exportación de un lector de placas. También representará gráficamente los valores interpolados.

Guía paso a paso

Paso 1: Carga tus datos

Abre un archivo nuevo de Graphing y haz clic en Choose a file (1), o arrastra el archivo. Los formatos compatibles son .csv, .xlsx, .xls, .prism y .pzfx, hasta 50 MB.

Paso 2: Elige el conjunto de datos que quieres importar

Si tu libro contiene varios conjuntos de datos, marca el que necesitas (1) y haz clic en Import data (2).

Paso 3: Comprueba la disposición de los datos

Este conjunto de datos de ejemplo es similar a los datos de muestra del cribado de fármacos mediante ELISA disponibles en BioRender Graphing, y está organizado como una salida en formato largo de un lector de placas. Los estándares tienen una concentración conocida en conc_std (1). Las muestras desconocidas solo tienen una respuesta en la misma columna de valores, además de una etiqueta de tratamiento (2).

Paso 4: Crea una variable para los valores de DO de los estándares

1. En el panel Variables, haz clic en + para añadir una variable. Llámala, por ejemplo, ODval_std 
2. Haz clic en Select cells.
3. Haz clic en "Save".

Paso 5: Selecciona las celdas de los estándares

1. Arrastra sobre las celdas de respuesta de los estándares. 
2. El intervalo aparece en el cuadro (en este ejemplo, C2:C25).
3. Haz clic en "Done".
4. "Save".

Paso 6: Crea una variable para los valores de DO de los pocillos desconocidos

1. Añade una segunda variable (por ejemplo, ODval_unk). 
2. Con el intervalo de las muestras desconocidas (por ejemplo, C26:C97).
3. Haz clic en "Save".

Paso 7: Confirma ambas variables

ODval_std y ODval_unk aparecen ahora en el panel "Variables" (1).

Paso 8: Crea un gráfico nuevo

En Graphs, haz clic en "Create new" (1).

Paso 9: Elige Dose response curve

Abre la lista de tipos de Graph y selecciona "Dose response curve" (1).

Paso 10: Asigna las variables

1. Establece la variable del eje X como la concentración, conc_std.
2. Establece la variable del eje Y como la respuesta de los estándares, ODval_std. 
3. A continuación, haz clic en "Continue".

Paso 11 (opcional): Usa un eje X logarítmico

1. Haz clic en el eje x
2. Establece "Axis scale" como Log10 
3. Como alternativa, pide a "Quick edit" que establezca el eje inferior en logaritmo en base 10.

Paso 12: Run un análisis nuevo

En el panel izquierdo, haz clic en Run new analysis (1).

Paso 13: Elige la regression

1. Establece Analysis type como Nonlinear Regression y Regression Type como "Dose-Response Regression". 
2. En Dose response model, elige "Stimulation" si la respuesta aumenta con la dosis, o "Inhibition" si disminuye.

Paso 14: Muestra las opciones de interpolación

Desplázate hasta Step 3 - Follow-up analyses y haz clic en Show interpolation options (1).

Paso 15: Selecciona las muestras desconocidas

1. Abre Values to interpolate.
2. Elige la variable que contiene tus muestras desconocidas.

Paso 16: Elige la dirección y ejecuta el análisis

1. Confirma la variable. 
2. En Interpolation direction, elige Find X from Y para obtener concentraciones a partir de las respuestas.
3. Como alternativa, elige find Y from X para predecir respuestas a partir de concentraciones. 
4. Interpolation aparece ahora marcada en "Follow-up analyses".
5. Haz clic en "Run analysis".

Paso 17: Consulta la curva ajustada

• Cada análisis se guarda en Reports (3).  
• En Show analysis (1), selecciona la Dose-Response Regression que acabas de ejecutar; la curva ajustada aparecerá en el gráfico. 
• Si quieres, activa Best-fit curve, 95% Confidence interval, etc. (2). 

Paso 18: Abre el informe

1. Haz clic en el informe Dose Response Regression de Reports. En él se muestran los valores del mejor ajuste (EC50), los coeficientes de la curva (Top, Bottom, Hill slope) y la bondad del ajuste. 
2. A continuación aparecen los valores interpolados de tus muestras desconocidas.

Paso 19: Lee los valores interpolados

1. Input es el valor medido y Predicted es el valor interpolado, mostrado con su IC del 95 %. 
2. “Within 2% of a plateau” significa que el resultado está mal determinado. 
3. NA con “No result can be calculated for this value” significa que el valor de entrada queda fuera de Top y Bottom de la curva (3). 
4. Haz clic en Add as new dataset para tratar esta tabla como un conjunto de datos para análisis posteriores.

Paso 20: Abre el nuevo conjunto de datos

1. Aparece una pestaña nueva con los valores interpolados en la parte inferior de la vista de datos. Puedes copiar y pegar las etiquetas de tratamiento de las muestras desconocidas desde los datos originales en este conjunto de datos, bajo el encabezado Sample, para que conserven las etiquetas correspondientes. 
2. A continuación, haz clic en "Detect variables" para asignar variables a cada columna.

Paso 21: Comprueba las variables detectadas

Sample, Input, Predicted, 95% CI y Notes son ahora variables.

Paso 22: Graph los valores interpolados

Crea un gráfico nuevo. 

1. Selecciona el conjunto de datos interpolados.
2. Selecciona un tipo de gráfico como Mean/median line. 
3. Establece la variable del eje X como Sample.
4. Establece la variable del eje Y como Predicted.
5. Haz clic en "Continue".

Paso 23 (opcional): Excluye un valor poco fiable

1. Para eliminar un valor mal determinado, como el 192,19 marcado como within 2% of a plateau, haz clic con el botón derecho en él dentro de los datos "Displayed".
2. Elige "Exclude".

Paso 24: Comprueba el gráfico actualizado

1. El eje Y cambia de escala.
2. El valor aparece atenuado.

Solución de problemas frecuentes

El resultado muestra "NA" con el mensaje "No result can be calculated for this value"

Esto ocurre cuando el valor de entrada está por encima de Top o por debajo de Bottom de la curva estándar ajustada.

Por ejemplo, los valores 2,1 o 0,02 quedan fuera de una curva con un Top ajustado de 2,04 y un Bottom de 0,08.

Para resolverlo:

• Comprueba que las mediciones sean correctas.
• Si es necesario, vuelve a analizar la muestra con una dilución que produzca una medición dentro del intervalo de la curva estándar.

El resultado muestra "Within 2% of a plateau"

Los valores próximos a Top o Bottom de la curva estándar son menos fiables y pueden producir resultados extremos o un intervalo de confianza (IC) del 95 % amplio o ausente.

Para resolverlo:

• Siempre que sea posible, utiliza muestras que se encuentren en la parte central, más inclinada, de la curva estándar.
• Como alternativa, excluye el valor afectado del análisis (consulta el paso 23).

La variable de muestras desconocidas no aparece en "Values to interpolate"

Las variables ya asignadas a los ejes del gráfico, como conc_std y ODval_std, no aparecen en la lista "Values to interpolate".

Para resolverlo:

• Crea las muestras desconocidas como una variable independiente siguiendo los pasos 4 a 6.
• Vuelve a "Values to interpolate" y selecciona la variable que acabas de crear.

Una prueba estadística muestra "Category 'drug_2' has 1 samples, needs at least 2"

Este error se produce cuando un grupo no tiene suficientes resultados válidos para realizar la prueba estadística.

Por ejemplo, si dos de los tres resultados de drug_2 son NA, solo queda un valor válido.

Para resolverlo:

• Revisa el grupo para comprobar si hay resultados NA.
• Si el grupo tiene menos de dos valores válidos, desmárcalo en "Select categorical groups" antes de volver a ejecutar la prueba estadística.

Preguntas frecuentes

¿Por qué se crean variables independientes para los estándares y las muestras desconocidas?

Ambos se encuentran en la misma columna de valores. Las variables independientes indican a Graphing qué celdas se utilizan para ajustar la curva y qué celdas se deben interpolar.

¿Cuándo debo utilizar Find X from Y en lugar de Find Y from X?

Utiliza Find X from Y para estimar una concentración a partir de una respuesta medida. Utiliza Find Y from X para predecir una respuesta a partir de una concentración conocida.

¿Qué modelo de respuesta a la dosis debo elegir?

Los kits de ELISA suelen recomendar un modelo de 4PL dose-response para ajustar las curvas estándar. Si todos tus valores de DO para la curva estándar se encuentran dentro del intervalo lineal de respuesta, también sería válido interpolar a partir de un modelo lineal siguiendo un flujo de trabajo similar al descrito anteriormente.