Cómo ajustar una curva estándar e interpolar valores desconocidos a partir de datos de placas

Esta guía muestra cómo ajustar una curva estándar de dose-response en BioRender Graphing y utilizarla para interpolar muestras desconocidas cuando los estándares y las muestras desconocidas se encuentran en la misma columna de datos, como en una exportación de un lector de placas. También representará gráficamente los valores interpolados.

Nota: El agente de Graphing no admite actualmente la interpolación de curvas estándar. Para interpolar muestras desconocidas, siga los pasos manuales de esta guía.

Paso 1: Cargue los datos

Abra un archivo nuevo de Graphing y haga clic en Elegir un archivo (1), o arrastre el archivo. Los formatos compatibles son .csv, .xlsx, .xls, .prism y .pzfx, hasta 50 MB.

Paso 2: Elija el conjunto de datos que desea importar

Si el libro contiene varios conjuntos de datos, marque el que necesite (1) y haga clic en Importar datos (2).

Paso 3: Compruebe la disposición de los datos

Este conjunto de datos de ejemplo es similar a los datos de muestra de cribado de fármacos ELISA disponibles en BioRender Graphing, y está organizado como un resultado en formato largo de un lector de placas. Los estándares tienen una concentración conocida en conc_std (1). Las muestras desconocidas solo tienen una respuesta en la misma columna de valores, además de una etiqueta de tratamiento (2).

Paso 4: Cree una variable para los valores de DO de los estándares

1. En el panel Variables, haga clic en + para añadir una variable. Asígnele, por ejemplo, el nombre ODval_std 
2. Haga clic en Seleccionar celdas.
3. Haga clic en "Save".

Paso 5: Seleccione las celdas de los estándares

1. Arrastre sobre las celdas de respuesta de los estándares. 
2. El intervalo aparece en el cuadro (en este ejemplo, C2:C25).
3. Haga clic en "Done".
4. "Save".

Paso 6: Cree una variable para los valores de DO de los pocillos desconocidos

1. Añada una segunda variable (por ejemplo, ODval_unk). 
2. Con el intervalo de las muestras desconocidas (por ejemplo, C26:C97).
3. Haga clic en "Save".

Paso 7: Confirme ambas variables

ODval_std y ODval_unk aparecen ahora en el panel "Variables" (1).

Paso 8: Cree un gráfico nuevo

En Gráficos, haga clic en "Crear nuevo" (1).

Paso 9: Elija la curva de respuesta a dosis

Abra la lista de tipos de Graph y seleccione "Curva de respuesta a dosis" (1).

Paso 10: Asigne las variables

1. Establezca la variable del eje X en la concentración, conc_std.
2. Establezca la variable del eje Y en la respuesta de los estándares, ODval_std. 
3. A continuación, haga clic en "Continue".

Paso 11 (opcional): Utilice un eje X logarítmico

1. Haga clic en el eje X
2. Establezca "Escala del eje" en Log10 
3. También puede pedir a "Quick edit" que establezca el eje inferior en logaritmo en base 10.

Paso 12: Run un análisis nuevo

En el panel izquierdo, haga clic en Run nuevo análisis (1).

Paso 13: Elija la regression

1. Establezca Tipo de análisis en Regresión no lineal y Tipo de regresión en "Regresión de respuesta a dosis". 
2. En Modelo de respuesta a dosis, elija "Estimulación" si la respuesta aumenta con la dosis, o "Inhibición" si disminuye.

Paso 14: Muestre las opciones de interpolación

Desplácese hasta Paso 3 - Análisis de seguimiento y haga clic en Mostrar opciones de interpolación (1).

Paso 15: Seleccione las muestras desconocidas

1. Abra Valores que se van a interpolar.
2. Elija la variable que contiene las muestras desconocidas.

Paso 16: Elija la dirección y ejecute el análisis

1. Confirme la variable. 
2. En Dirección de interpolación, elija Buscar X a partir de Y para obtener concentraciones a partir de las respuestas.
3. También puede elegir buscar Y a partir de X para predecir respuestas a partir de concentraciones. 
4. La opción Interpolación aparece ahora marcada en "Análisis de seguimiento".
5. Haga clic en "Run analysis".

Paso 17: Vea la curva ajustada

• Cada análisis se guarda en Informes (3).  
• En Mostrar análisis (1), seleccione la regresión de respuesta a dosis que acaba de ejecutar y la curva ajustada aparecerá en el gráfico. 
• Si lo desea, active Curva de mejor ajuste, Intervalo de confianza del 95 %, etc. (2). 

Paso 18: Abra el informe

1. Haga clic en el informe Dose Response Regression en Informes. Enumera los valores del mejor ajuste (EC50), los coeficientes de la curva (Superior, Inferior, Pendiente de Hill) y la bondad del ajuste. 
2. A continuación aparecen los valores interpolados de las muestras desconocidas.

Paso 19: Lea los valores interpolados

1. Entrada es el valor medido y Predicho es el valor interpolado, mostrado con su IC del 95 %. 
2. “Dentro del 2 % de una meseta” significa que el resultado está mal determinado. 
3. NA con “No se puede calcular ningún resultado para este valor” significa que la entrada queda fuera de los valores Superior e Inferior de la curva (3). 
4. Haga clic en Añadir como nuevo conjunto de datos para tratar esta tabla como un conjunto de datos para análisis posteriores.

Paso 20: Abra el nuevo conjunto de datos

1. Aparece una nueva pestaña con los valores interpolados en la parte inferior de la vista de datos. Puede copiar y pegar las etiquetas de tratamiento de las muestras desconocidas de los datos originales en este conjunto de datos, bajo el encabezado Muestra, para que conserven las etiquetas relevantes. 
2. A continuación, haga clic en "Detectar variables" para asignar variables a cada columna.

Paso 21: Compruebe las variables detectadas

Muestra, Entrada, Predicho, IC del 95 % y Notas son ahora variables.

Paso 22: Graph los valores interpolados

Cree un gráfico nuevo. 

1. Seleccione el conjunto de datos interpolados.
2. Seleccione un tipo de gráfico, como Línea de media/mediana. 
3. Establezca la variable del eje X en Muestra.
4. Establezca la variable del eje Y en Predicho.
5. Haga clic en "Continue".

Paso 23 (opcional): Excluya un valor poco fiable

1. Para eliminar un valor mal determinado, como el 192,19 marcado como dentro del 2 % de una meseta, haga clic con el botón derecho en él en los datos "Mostrados".
2. Elija "Excluir".

Paso 24: Compruebe el gráfico actualizado

1. El eje Y se reajusta.
2. El valor aparece atenuado.

Solución de problemas habituales

El resultado muestra "NA" con el mensaje "No se puede calcular ningún resultado para este valor"

Esto ocurre cuando el valor de entrada está por encima del valor Superior ajustado o por debajo del valor Inferior ajustado de la curva estándar.

Por ejemplo, los valores 2,1 o 0,02 quedan fuera de una curva con un valor Superior ajustado de 2,04 y un valor Inferior de 0,08.

Para resolverlo:

• Compruebe que las mediciones sean correctas.
• Si es necesario, vuelva a analizar la muestra con una dilución que produzca una medición dentro del intervalo de la curva estándar.

El resultado muestra "Dentro del 2 % de una meseta"

Los valores próximos al valor Superior o Inferior de la curva estándar son menos fiables y pueden producir resultados extremos o un intervalo de confianza (IC) del 95 % amplio o ausente.

Para resolverlo:

• Siempre que sea posible, utilice muestras que queden dentro de la parte central más inclinada de la curva estándar.
• También puede excluir el valor afectado del análisis (consulte el Paso 23).

La variable de muestras desconocidas no aparece en "Valores que se van a interpolar"

Las variables ya asignadas a los ejes del gráfico, como conc_std y ODval_std, no aparecerán en la lista "Valores que se van a interpolar".

Para resolverlo:

• Cree las muestras desconocidas como una variable independiente siguiendo los pasos 4 a 6.
• Vuelva a "Valores que se van a interpolar" y seleccione la variable que acaba de crear.

Una prueba estadística muestra "La categoría 'drug_2' tiene 1 muestra; necesita al menos 2"

Este error ocurre cuando un grupo no tiene suficientes resultados válidos para realizar la prueba estadística.

Por ejemplo, si dos de los tres resultados de drug_2 son NA, solo queda un valor válido.

Para resolverlo:

• Revise el grupo para comprobar si hay resultados NA.
• Si el grupo tiene menos de dos valores válidos, deselecciónelo en "Seleccionar grupos categóricos" antes de volver a ejecutar la prueba estadística.

Preguntas frecuentes

¿Por qué crear variables independientes para los estándares y las muestras desconocidas?

Ambos se encuentran en la misma columna de valores. Las variables independientes indican a Graphing qué celdas deben utilizarse para ajustar la curva y qué celdas deben interpolarse.

¿Cuándo debo utilizar Buscar X a partir de Y frente a Buscar Y a partir de X?

Utilice Buscar X a partir de Y para estimar una concentración a partir de una respuesta medida. Utilice Buscar Y a partir de X para predecir una respuesta a partir de una concentración conocida.

¿Qué modelo de respuesta a dosis debo elegir?

Los kits ELISA suelen recomendar un modelo de respuesta a dosis 4PL dose-response para ajustar las curvas estándar.  Si todos los valores de DO de la curva estándar se encuentran dentro del intervalo lineal de respuesta, también sería válido interpolar a partir de un modelo lineal utilizando un flujo de trabajo similar al descrito anteriormente.