Comment ajuster une courbe standard et interpoler des valeurs inconnues à partir de données de plaque

Ce guide explique comment ajuster une courbe standard de dose-response dans BioRender Graphing et l’utiliser pour interpoler des échantillons inconnus lorsque les standards et les inconnus se trouvent dans la même colonne de données, comme dans une exportation de lecteur de plaque. Vous tracerez également les valeurs interpolées.

Guide étape par étape

Étape 1 : Importer vos données

Ouvrez un nouveau fichier Graphing et cliquez sur Choose a file (1), ou faites glisser votre fichier. Les formats pris en charge sont .csv, .xlsx, .xls, .prism et .pzfx, jusqu’à 50 Mo.

Étape 2 : Choisir le jeu de données à importer

Si votre classeur contient plusieurs jeux de données, cochez celui dont vous avez besoin (1), puis cliquez sur Import data (2).

Étape 3 : Vérifier la structure des données

Ce jeu de données d’exemple est similaire aux données d’échantillon de dépistage de médicaments par ELISA disponibles dans BioRender Graphing, et est organisé dans un format long provenant d’un lecteur de plaque. Les standards ont une concentration connue dans conc_std (1). Les inconnus disposent uniquement d’une réponse dans la même colonne de valeurs, ainsi que d’un libellé de traitement (2).

Étape 4 : Créer une variable pour les valeurs de DO des standards

1. Dans le panneau Variables, cliquez sur + pour ajouter une variable. Nommez-la, par exemple ODval_std 
2. Cliquez sur Select cells.
3. Cliquez sur "Save".

Étape 5 : Sélectionner les cellules des standards

1. Faites glisser le curseur sur les cellules de réponse des standards. 
2. La plage apparaît dans la zone (dans cet exemple, C2:C25).
3. Cliquez sur "Done".
4. "Save".

Étape 6 : Créer une variable pour les valeurs de DO des puits inconnus

1. Ajoutez une deuxième variable (par exemple ODval_unk). 
2. Avec la plage des inconnus (par exemple, C26:C97).
3. Cliquez sur "Save".

Étape 7 : Confirmer les deux variables

ODval_std et ODval_unk apparaissent maintenant dans le panneau « Variables » (1).

Étape 8 : Créer un nouveau graphique

Sous Graphs, cliquez sur « Create new » (1).

Étape 9 : Choisir Dose response curve

Ouvrez la liste des types de Graph et sélectionnez « Dose response curve » (1).

Étape 10 : Attribuer les variables

1. Définissez la variable de l’axe X sur la concentration, conc_std.
2. Définissez la variable de l’axe Y sur la réponse des standards, ODval_std. 
3. Cliquez ensuite sur "Continue".

Étape 11 (facultative) : Utiliser un axe X logarithmique

1. Cliquez sur l’axe X
2. Définissez « Axis scale » sur Log10 
3. Vous pouvez également demander à "Quick edit" de définir l’axe inférieur sur une base logarithmique 10.

Étape 12 : Run une nouvelle analyse

Dans le panneau de gauche, cliquez sur Run new analysis (1).

Étape 13 : Choisir la regression

1. Définissez Analysis type sur Nonlinear Regression et Regression Type sur « Dose-Response Regression ». 
2. Sous Dose response model, choisissez « Stimulation » si la réponse augmente avec la dose, ou « Inhibition » si elle diminue.

Étape 14 : Afficher les options d’interpolation

Faites défiler jusqu’à Step 3 - Follow-up analyses, puis cliquez sur Show interpolation options (1).

Étape 15 : Sélectionner les inconnus

1. Ouvrez Values to interpolate.
2. Sélectionnez la variable qui contient vos inconnus.

Étape 16 : Choisir la direction et exécuter l’analyse

1. Confirmez la variable. 
2. Sous Interpolation direction, choisissez Find X from Y pour obtenir les concentrations à partir des réponses.
3. Vous pouvez également choisir Find Y from X pour prédire les réponses à partir des concentrations. 
4. Interpolation est maintenant coché sous « Follow-up analyses ».
5. Cliquez sur "Run analysis".

Étape 17 : Afficher la courbe ajustée

• Chaque analyse est enregistrée sous Reports (3).  
• Sous Show analysis (1), sélectionnez la Dose-Response Regression que vous venez d’exécuter ; la courbe ajustée apparaît sur le graphique. 
• Vous pouvez éventuellement activer Best-fit curve, 95% Confidence interval, etc. (2). 

Étape 18 : Ouvrir le rapport

1. Cliquez sur le rapport Dose Response Regression sous Reports. Il répertorie les valeurs du meilleur ajustement (EC50), les coefficients de la courbe (Top, Bottom, Hill slope) et la qualité de l’ajustement. 
2. Les valeurs interpolées de vos inconnus apparaissent ensuite.

Étape 19 : Lire les valeurs interpolées

1. Input correspond à votre valeur mesurée et Predicted à la valeur interpolée, accompagnée de son IC à 95 %. 
2. « Within 2% of a plateau » signifie que le résultat est peu déterminé. 
3. NA accompagné de « No result can be calculated for this value » signifie que l’entrée se situe en dehors des valeurs Top et Bottom de la courbe (3). 
4. Cliquez sur Add as new dataset pour traiter ce tableau comme un jeu de données destiné à des analyses ultérieures.

Étape 20 : Ouvrir le nouveau jeu de données

1. Un nouvel onglet contenant les valeurs interpolées apparaît en bas de la vue des données. Vous pouvez copier-coller les libellés de traitement des inconnus depuis les données d’origine dans ce jeu de données, sous l’en-tête Sample, afin de leur attribuer les libellés correspondants. 
2. Cliquez ensuite sur « Detect variables » pour attribuer des variables à chaque colonne.

Étape 21 : Vérifier les variables détectées

Sample, Input, Predicted, 95% CI et Notes sont maintenant des variables.

Étape 22 : Tracer les valeurs interpolées avec Graph

Créez un nouveau graphique. 

1. Sélectionnez le jeu de données interpolé.
2. Sélectionnez un type de graphique tel que Mean/median line. 
3. Définissez la variable de l’axe X sur Sample.
4. Définissez la variable de l’axe Y sur Predicted.
5. Cliquez sur "Continue".

Étape 23 (facultative) : Exclure une valeur peu fiable

1. Pour supprimer une valeur peu déterminée, telle que 192,19, signalée comme étant within 2% of a plateau, cliquez dessus avec le bouton droit dans les données « Displayed ».
2. Choisissez « Exclude ».

Étape 24 : Vérifier le graphique mis à jour

1. L’axe Y est remis à l’échelle.
2. La valeur est grisée.

Résolution des problèmes courants

Le résultat affiche « NA » avec le message « No result can be calculated for this value »

Cela se produit lorsque la valeur d’entrée est supérieure à la valeur Top ajustée ou inférieure à la valeur Bottom ajustée de la courbe standard.

Par exemple, les valeurs 2,1 ou 0,02 se situent en dehors d’une courbe dont les valeurs Top et Bottom ajustées sont respectivement de 2,04 et 0,08.

Pour résoudre ce problème :

• Vérifiez que vos mesures sont correctes.
• Si nécessaire, analysez à nouveau l’échantillon avec une dilution produisant une mesure située dans la plage de la courbe standard.

Le résultat affiche « Within 2% of a plateau »

Les valeurs proches des valeurs Top ou Bottom de la courbe standard sont moins fiables et peuvent produire des résultats extrêmes ou un intervalle de confiance (IC) à 95 % large ou absent.

Pour résoudre ce problème :

• Utilisez autant que possible des échantillons qui se situent dans la partie centrale, plus pentue, de la courbe standard.
• Vous pouvez également exclure la valeur concernée de votre analyse (voir l’étape 23).

Votre variable d’inconnus n’apparaît pas sous « Values to interpolate »

Les variables déjà attribuées aux axes du graphique, telles que conc_std et ODval_std, n’apparaissent pas dans la liste « Values to interpolate ».

Pour résoudre ce problème :

• Créez vos inconnus en tant que variable distincte en suivant les étapes 4 à 6.
• Revenez à « Values to interpolate » et sélectionnez la variable que vous venez de créer.

Un test statistique affiche « Category 'drug_2' has 1 samples, needs at least 2 »

Cette erreur se produit lorsqu’un groupe ne contient pas suffisamment de résultats valides pour effectuer le test statistique.

Par exemple, si deux des trois résultats drug_2 sont NA, il ne reste qu’une seule valeur valide.

Pour résoudre ce problème :

• Vérifiez si le groupe contient des résultats NA.
• Si le groupe contient moins de deux valeurs valides, désélectionnez-le sous « Select categorical groups » avant de relancer le test statistique.

Foire aux questions

Pourquoi créer des variables distinctes pour les standards et les inconnus ?

Les deux se trouvent dans la même colonne de valeurs. Les variables distinctes indiquent à Graphing quelles cellules doivent servir à ajuster la courbe et quelles cellules doivent être interpolées.

Quand dois-je utiliser Find X from Y plutôt que Find Y from X ?

Utilisez Find X from Y pour estimer une concentration à partir d’une réponse mesurée. Utilisez Find Y from X pour prédire une réponse à partir d’une concentration connue.

Quel modèle de dose-réponse dois-je choisir ?

Les kits ELISA recommandent généralement un modèle de 4PL dose-response pour ajuster les courbes standard.  Si vos valeurs de DO pour la courbe standard se situent toutes dans la plage de réponse linéaire, il serait tout aussi valide d’interpoler à partir d’un modèle linéaire en suivant un processus similaire à celui décrit ci-dessus.