So passen Sie eine Standardkurve an und interpolieren unbekannte Werte aus Plattendaten

Dieser Leitfaden zeigt, wie Sie eine dose-response-Standardkurve in BioRender Graphing anpassen und damit unbekannte Proben interpolieren, wenn sich Standards und unbekannte Werte in derselben Datenspalte befinden, wie bei einem Export aus einem Plattenlesegerät. Außerdem werden die interpolierten Werte grafisch dargestellt.

Hinweis: Der Graphing-Agent unterstützt derzeit keine Interpolation von Standardkurven. Befolgen Sie zum Interpolieren unbekannter Proben die manuellen Schritte in diesem Leitfaden.

Schritt 1: Daten hochladen

Öffnen Sie eine neue Graphing-Datei und klicken Sie auf Choose a file (1), oder ziehen Sie Ihre Datei hinein. Unterstützte Formate sind .csv, .xlsx, .xls, .prism und .pzfx bis zu 50 MB.

Schritt 2: Datensatz zum Importieren auswählen

Wenn Ihre Arbeitsmappe mehrere Datensätze enthält, aktivieren Sie den benötigten Datensatz (1) und klicken Sie auf Import data (2).

Schritt 3: Datenlayout überprüfen

Dieser Beispieldatensatz ähnelt den ELISA-Drogenscreening-Beispieldaten, die in BioRender Graphing verfügbar sind, und ist als Ausgabe im Langformat eines Plattenlesegeräts angeordnet. Standards haben eine bekannte Konzentration in conc_std (1). Unbekannte Werte haben nur eine Antwort in derselben Wertespalte sowie eine Behandlungsbezeichnung (2).

Schritt 4: Variable für die OD-Werte der Standards erstellen

1. Klicken Sie im Bereich „Variablen“ auf +, um eine Variable hinzuzufügen. Nennen Sie sie beispielsweise ODval_std 
2. Klicken Sie auf Select cells.
3. Klicken Sie auf "Save".

Schritt 5: Zellen der Standards auswählen

1. Ziehen Sie über die Antwortzellen der Standards. 
2. Der Bereich wird im Feld angezeigt (in diesem Beispiel C2:C25).
3. Klicken Sie auf "Done".
4. "Save".

Schritt 6: Variable für die OD-Werte der unbekannten Wells erstellen

1. Fügen Sie eine zweite Variable hinzu (zum Beispiel ODval_unk). 
2. Mit dem Bereich der unbekannten Werte (Beispiel: C26:C97).
3. Klicken Sie auf "Save".

Schritt 7: Beide Variablen bestätigen

ODval_std und ODval_unk werden nun im Bereich „Variablen“ angezeigt (1).

Schritt 8: Neues Diagramm erstellen

Klicken Sie unter „Diagramme“ auf „Create new“ (1).

Schritt 9: Dose response curve auswählen

Öffnen Sie die Liste für den Graph-Typ und wählen Sie „Dose response curve“ (1).

Schritt 10: Variablen zuweisen

1. Legen Sie die Variable für die X-Achse auf die Konzentration conc_std fest.
2. Legen Sie die Variable für die Y-Achse auf die Antwort der Standards, ODval_std, fest. 
3. Klicken Sie anschließend auf "Continue".

Schritt 11 (optional): Logarithmische X-Achse verwenden

1. Klicken Sie auf die X-Achse.
2. Setzen Sie „Axis scale“ auf Log10 
3. Alternativ können Sie "Quick edit" auffordern, die untere Achse auf den Logarithmus zur Basis 10 zu setzen.

Schritt 12: Neue Analyse Run

Klicken Sie im linken Bereich auf Run new analysis (1).

Schritt 13: regression auswählen

1. Setzen Sie Analysis type auf Nonlinear Regression und Regression Type auf „Dose-Response Regression“. 
2. Wählen Sie unter Dose response model „Stimulation“, wenn die Antwort mit der Dosis steigt, oder „Inhibition“, wenn sie sinkt.

Schritt 14: Interpolationsoptionen anzeigen

Scrollen Sie zu Step 3 - Follow-up analyses und klicken Sie auf Show interpolation options (1).

Schritt 15: Unbekannte Werte auswählen

1. Öffnen Sie Values to interpolate.
2. Wählen Sie die Variable aus, die Ihre unbekannten Werte enthält.

Schritt 16: Richtung auswählen und ausführen

1. Bestätigen Sie die Variable. 
2. Wählen Sie unter Interpolation direction die Option Find X from Y, um Konzentrationen aus Antworten zu ermitteln.
3. Alternativ können Sie Find Y from X auswählen, um Antworten aus Konzentrationen vorherzusagen. 
4. Interpolation ist nun unter „Follow-up analyses“ aktiviert.
5. Klicken Sie auf "Run analysis".

Schritt 17: Angepasste Kurve anzeigen

• Jede Analyse wird unter Reports (3) gespeichert.  
• Wählen Sie unter Show analysis (1) die soeben ausgeführte Dose-Response Regression aus. Die angepasste Kurve wird im Diagramm angezeigt. 
• Optional können Sie Best-fit curve, 95% Confidence interval usw. aktivieren bzw. deaktivieren (2). 

Schritt 18: Bericht öffnen

1. Klicken Sie unter Reports auf den Bericht Dose Response Regression. Er enthält die Best-Fit-Werte (EC50), die Kurvenkoeffizienten (Top, Bottom, Hill slope) und die Anpassungsgüte. 
2. Darauf folgen die interpolierten Werte für Ihre unbekannten Proben.

Schritt 19: Interpolierte Werte ablesen

1. Input ist Ihr gemessener Wert und Predicted der interpolierte Wert, der mit seinem 95%-KI angezeigt wird. 
2. „Within 2% of a plateau“ bedeutet, dass das Ergebnis ungenau bestimmt ist. 
3. NA mit „No result can be calculated for this value“ bedeutet, dass der Input außerhalb von Top und Bottom der Kurve liegt (3). 
4. Klicken Sie auf Add as new dataset, um diese Tabelle für weitere Analysen als Datensatz zu verwenden.

Schritt 20: Neuen Datensatz öffnen

1. Unten in der Datenansicht wird eine neue Registerkarte mit den interpolierten Werten angezeigt. Sie können die Behandlungsbezeichnungen der unbekannten Werte aus den ursprünglichen Daten in diesem Datensatz unter der Überschrift Sample kopieren und einfügen, damit sie relevante Bezeichnungen enthalten. 
2. Klicken Sie anschließend auf „Detect variables“, um jeder Spalte Variablen zuzuweisen.

Schritt 21: Erkannte Variablen überprüfen

Sample, Input, Predicted, 95% CI und Notes sind nun Variablen.

Schritt 22: Interpolierte Werte Graph

Erstellen Sie ein neues Diagramm. 

1. Wählen Sie den interpolierten Datensatz aus.
2. Wählen Sie einen Diagrammtyp wie Mean/median line. 
3. Setzen Sie die Variable für die X-Achse auf Sample.
4. Setzen Sie die Variable für die Y-Achse auf Predicted.
5. Klicken Sie auf "Continue".

Schritt 23 (optional): Unzuverlässigen Wert ausschließen

1. Um einen ungenau bestimmten Wert zu entfernen, beispielsweise 192.19, der mit Within 2% of a plateau gekennzeichnet ist, klicken Sie in den „Displayed“-Daten mit der rechten Maustaste darauf.
2. Wählen Sie „Exclude“.

Schritt 24: Aktualisiertes Diagramm überprüfen

1. Die Y-Achse wird neu skaliert.
2. Der Wert wird grau dargestellt.

Fehlerbehebung bei häufigen Problemen

Das Ergebnis zeigt „NA“ mit der Meldung „No result can be calculated for this value“ an

Dies tritt auf, wenn der Eingabewert über dem angepassten Top oder unter dem angepassten Bottom der Standardkurve liegt.

Beispielsweise liegen die Werte 2.1 oder 0.02 außerhalb einer Kurve mit einem angepassten Top von 2.04 und Bottom von 0.08.

So beheben Sie das Problem:

• Überprüfen Sie, ob Ihre Messungen korrekt sind.
• Falls erforderlich, wiederholen Sie die Probe in einer Verdünnung, die eine Messung innerhalb des Bereichs der Standardkurve ergibt.

Das Ergebnis zeigt „Within 2% of a plateau“ an

Werte nahe am Top oder Bottom der Standardkurve sind weniger zuverlässig und können extreme Ergebnisse oder ein breites bzw. fehlendes 95%-Konfidenzintervall (KI) ergeben.

So beheben Sie das Problem:

• Verwenden Sie möglichst Proben, die im steileren mittleren Bereich der Standardkurve liegen.
• Alternativ können Sie den betroffenen Wert aus Ihrer Analyse ausschließen (siehe Schritt 23).

Ihre Variable für die unbekannten Werte wird unter „Values to interpolate“ nicht angezeigt

Variablen, die bereits den Diagrammachsen zugewiesen sind, wie conc_std und ODval_std, werden nicht in der Liste „Values to interpolate“ angezeigt.

So beheben Sie das Problem:

• Erstellen Sie Ihre unbekannten Werte als separate Variable, indem Sie die Schritte 4 bis 6 befolgen.
• Kehren Sie zu „Values to interpolate“ zurück und wählen Sie die neu erstellte Variable aus.

Ein statistischer Test zeigt „Category 'drug_2' has 1 samples, needs at least 2“ an

Dieser Fehler tritt auf, wenn eine Gruppe nicht über genügend gültige Ergebnisse verfügt, um den statistischen Test durchzuführen.

Wenn beispielsweise zwei der drei Ergebnisse von drug_2 NA sind, bleibt nur ein gültiger Wert übrig.

So beheben Sie das Problem:

• Überprüfen Sie die Gruppe auf NA-Ergebnisse.
• Wenn die Gruppe weniger als zwei gültige Werte enthält, deaktivieren Sie sie unter „Select categorical groups“, bevor Sie den statistischen Test erneut ausführen.

Häufig gestellte Fragen

Warum separate Variablen für Standards und unbekannte Werte erstellen?

Beide befinden sich in derselben Wertespalte. Separate Variablen teilen Graphing mit, welche Zellen zum Anpassen der Kurve und welche Zellen zum Interpolieren verwendet werden sollen.

Wann sollte ich Find X from Y und wann Find Y from X verwenden?

Verwenden Sie Find X from Y, um eine Konzentration aus einer gemessenen Antwort zu schätzen. Verwenden Sie Find Y from X, um eine Antwort aus einer bekannten Konzentration vorherzusagen.

Welches Dosis-Wirkungs-Modell sollte ich auswählen?

ELISA-Kits empfehlen im Allgemeinen ein 4PL-dose-response-Modell zur Anpassung von Standardkurven.  Wenn Ihre OD-Werte für die Standardkurve alle innerhalb des linearen Antwortbereichs liegen, ist es ebenso gültig, aus einem linearen Modell zu interpolieren, wobei ein ähnlicher Ablauf wie oben beschrieben verwendet wird.