So passen Sie eine Standardkurve an und interpolieren unbekannte Werte aus Plattendaten

Dieser Leitfaden zeigt, wie Sie eine dose-response-Standardkurve in BioRender Graphing anpassen und damit unbekannte Proben interpolieren, wenn sich Standards und Unbekannte in derselben Datenspalte befinden, wie bei einem Export aus einem Plattenlesegerät. Außerdem erstellen Sie eine grafische Darstellung der interpolierten Werte.

Schritt-für-Schritt-Anleitung

Schritt 1: Laden Sie Ihre Daten hoch

Öffnen Sie eine neue Graphing-Datei und klicken Sie auf Datei auswählen (1), oder ziehen Sie Ihre Datei hinein. Unterstützte Formate sind .csv, .xlsx, .xls, .prism und .pzfx bis zu einer Größe von 50 MB.

Schritt 2: Wählen Sie den zu importierenden Datensatz aus

Wenn Ihre Arbeitsmappe mehrere Datensätze enthält, markieren Sie den benötigten Datensatz (1) und klicken Sie auf Daten importieren (2).

Schritt 3: Überprüfen Sie das Datenlayout

Dieser Beispieldatensatz ähnelt den Beispieldaten für ein ELISA-Arzneimittelscreening, die in BioRender Graphing verfügbar sind, und ist als Ausgabe im Langformat eines Plattenlesegeräts angeordnet. Standards haben in conc_std eine bekannte Konzentration (1). Unbekannte enthalten in derselben Wertespalte nur eine Antwort sowie eine Behandlungsbezeichnung (2).

Schritt 4: Erstellen Sie eine Variable für die OD-Werte der Standards

1. Klicken Sie im Bereich Variablen auf +, um eine Variable hinzuzufügen. Geben Sie ihr beispielsweise den Namen ODval_std 
2. Klicken Sie auf Zellen auswählen.
3. Klicken Sie auf "Save".

Schritt 5: Wählen Sie die Zellen der Standards aus

1. Ziehen Sie über die Antwortzellen der Standards. 
2. Der Bereich wird im Feld angezeigt (in diesem Beispiel C2:C25).
3. Klicken Sie auf "Done".
4. "Save".

Schritt 6: Erstellen Sie eine Variable für die OD-Werte der unbekannten Wells

1. Fügen Sie eine zweite Variable hinzu (zum Beispiel ODval_unk). 
2. Wählen Sie den Bereich der Unbekannten aus (Beispiel: C26:C97).
3. Klicken Sie auf "Save".

Schritt 7: Bestätigen Sie beide Variablen

ODval_std und ODval_unk werden nun im Bereich „Variablen“ angezeigt (1).

Schritt 8: Erstellen Sie eine neue Grafik

Klicken Sie unter Grafiken auf „Neu erstellen“ (1).

Schritt 9: Wählen Sie „Dose response curve“

Öffnen Sie die Liste der Graph-Typen und wählen Sie „Dose response curve“ (1).

Schritt 10: Weisen Sie die Variablen zu

1. Legen Sie die Variable der X-Achse auf die Konzentration conc_std fest.
2. Legen Sie die Variable der Y-Achse auf die Antwort der Standards, ODval_std, fest. 
3. Klicken Sie anschließend auf "Continue".

Schritt 11 (optional): Verwenden Sie eine logarithmische X-Achse

1. Klicken Sie auf die X-Achse.
2. Legen Sie „Achsenskalierung“ auf Log10 fest. 
3. Alternativ können Sie "Quick edit" bitten, die untere Achse auf den Logarithmus zur Basis 10 einzustellen.

Schritt 12: Führen Sie eine neue Analyse aus

Klicken Sie im linken Bereich auf Run new analysis (1).

Schritt 13: Wählen Sie die regression aus

1. Legen Sie als Analysetyp „Nonlinear Regression“ und als Regressionstyp „Dose-Response Regression“ fest. 
2. Wählen Sie unter „Dose response model“ die Option „Stimulation“, wenn die Antwort mit der Dosis steigt, oder „Inhibition“, wenn sie fällt.

Schritt 14: Zeigen Sie die Interpolationsoptionen an

Scrollen Sie zu Schritt 3 – Folgeanalysen und klicken Sie auf Interpolationsoptionen anzeigen (1).

Schritt 15: Wählen Sie die Unbekannten aus

1. Öffnen Sie Werte zur Interpolation.
2. Wählen Sie die Variable aus, die Ihre Unbekannten enthält.

Schritt 16: Wählen Sie die Richtung aus und führen Sie die Analyse aus

1. Bestätigen Sie die Variable. 
2. Wählen Sie unter „Interpolationsrichtung“ die Option „Find X from Y“, um Konzentrationen aus Antworten zu ermitteln.
3. Alternativ können Sie „Find Y from X“ auswählen, um Antworten aus Konzentrationen vorherzusagen. 
4. Unter „Folgeanalysen“ ist nun „Interpolation“ ausgewählt.
5. Klicken Sie auf "Run analysis".

Schritt 17: Zeigen Sie die angepasste Kurve an

• Jede Analyse wird unter Berichte (3) gespeichert.  
• Wählen Sie unter Analyse anzeigen (1) die soeben ausgeführte Dose-Response-Regression aus. Die angepasste Kurve wird in der Grafik angezeigt. 
• Optional können Sie „Best-fit curve“, „95% Confidence interval“ usw. aktivieren oder deaktivieren (2). 

Schritt 18: Öffnen Sie den Bericht

1. Klicken Sie unter Berichte auf den Bericht Dose Response Regression. Er enthält die Best-Fit-Werte (EC50), die Kurvenkoeffizienten (Top, Bottom, Hill slope) und die Anpassungsgüte. 
2. Danach werden die interpolierten Werte für Ihre Unbekannten angezeigt.

Schritt 19: Lesen Sie die interpolierten Werte ab

1. „Input“ ist Ihr gemessener Wert und „Predicted“ der interpolierte Wert, der mit seinem 95-%-KI angezeigt wird. 
2. „Within 2% of a plateau“ bedeutet, dass das Ergebnis nur unzureichend bestimmt ist. 
3. NA mit der Meldung „No result can be calculated for this value“ bedeutet, dass der Input außerhalb von Top und Bottom der Kurve liegt (3). 
4. Klicken Sie auf Als neuen Datensatz hinzufügen, um diese Tabelle als Datensatz für weitere Analysen zu verwenden.

Schritt 20: Öffnen Sie den neuen Datensatz

1. Unten in der Datenansicht wird eine neue Registerkarte mit den interpolierten Werten angezeigt. Sie können die Behandlungsbezeichnungen der Unbekannten aus den Originaldaten in diesem Datensatz unter der Überschrift „Sample“ kopieren und einfügen, damit sie die entsprechenden Bezeichnungen übernehmen. 
2. Klicken Sie anschließend auf „Variablen erkennen“, um jeder Spalte Variablen zuzuweisen.

Schritt 21: Überprüfen Sie die erkannten Variablen

Sample, Input, Predicted, 95% CI und Notes sind nun Variablen.

Schritt 22: Erstellen Sie eine Grafik der interpolierten Werte

Erstellen Sie eine neue Grafik. 

1. Wählen Sie den interpolierten Datensatz aus.
2. Wählen Sie einen Grafiktyp wie „Mean/median line“ aus. 
3. Legen Sie die Variable der X-Achse auf Sample fest.
4. Legen Sie die Variable der Y-Achse auf Predicted fest.
5. Klicken Sie auf "Continue".

Schritt 23 (optional): Schließen Sie einen unzuverlässigen Wert aus

1. Um einen unzureichend bestimmten Wert zu entfernen, beispielsweise den als „Within 2% of a plateau“ markierten Wert 192,19, klicken Sie in den „Displayed“-Daten mit der rechten Maustaste darauf.
2. Wählen Sie „Exclude“ aus.

Schritt 24: Überprüfen Sie die aktualisierte Grafik

1. Die Y-Achse wird neu skaliert.
2. Der Wert wird ausgegraut.

Fehlerbehebung bei häufigen Problemen

Das Ergebnis zeigt „NA“ mit der Meldung „No result can be calculated for this value“ an

Dies tritt auf, wenn der Input-Wert über dem angepassten Top-Wert oder unter dem angepassten Bottom-Wert der Standardkurve liegt.

Beispielsweise liegen die Werte 2,1 oder 0,02 außerhalb einer Kurve mit einem angepassten Top-Wert von 2,04 und einem Bottom-Wert von 0,08.

So beheben Sie das Problem:

• Überprüfen Sie, ob Ihre Messungen korrekt sind.
• Falls erforderlich, führen Sie die Probe erneut mit einer Verdünnung aus, die eine Messung innerhalb des Bereichs der Standardkurve ergibt.

Das Ergebnis zeigt „Within 2% of a plateau“ an

Werte nahe am Top- oder Bottom-Wert der Standardkurve sind weniger zuverlässig und können extreme Ergebnisse oder ein breites bzw. fehlendes 95-%-Konfidenzintervall (KI) erzeugen.

So beheben Sie das Problem:

• Verwenden Sie nach Möglichkeit Proben, die im steileren mittleren Bereich der Standardkurve liegen.
• Alternativ können Sie den betroffenen Wert aus Ihrer Analyse ausschließen (siehe Schritt 23).

Ihre Variable für die Unbekannten wird nicht unter „Values to interpolate“ angezeigt

Variablen, die bereits den Grafikachsen zugewiesen sind, wie conc_std und ODval_std, werden nicht in der Liste „Values to interpolate“ angezeigt.

So beheben Sie das Problem:

• Erstellen Sie Ihre Unbekannten als separate Variable, indem Sie die Schritte 4 bis 6 befolgen.
• Kehren Sie zu „Values to interpolate“ zurück und wählen Sie Ihre neu erstellte Variable aus.

Ein statistischer Test zeigt „Category 'drug_2' has 1 samples, needs at least 2“ an

Dieser Fehler tritt auf, wenn eine Gruppe nicht genügend gültige Ergebnisse für die Durchführung des statistischen Tests enthält.

Wenn beispielsweise zwei der drei Ergebnisse für drug_2 NA sind, bleibt nur ein gültiger Wert übrig.

So beheben Sie das Problem:

• Überprüfen Sie die Gruppe auf NA-Ergebnisse.
• Wenn die Gruppe weniger als zwei gültige Werte enthält, deaktivieren Sie sie unter „Select categorical groups“, bevor Sie den statistischen Test erneut ausführen.

Häufig gestellte Fragen

Warum werden separate Variablen für Standards und Unbekannte erstellt?

Beide befinden sich in derselben Wertespalte. Separate Variablen zeigen Graphing, welche Zellen zum Anpassen der Kurve und welche Zellen zur Interpolation verwendet werden sollen.

Wann sollte ich „Find X from Y“ und wann „Find Y from X“ verwenden?

Verwenden Sie „Find X from Y“, um eine Konzentration aus einer gemessenen Antwort zu schätzen. Verwenden Sie „Find Y from X“, um eine Antwort aus einer bekannten Konzentration vorherzusagen.

Welches Dosis-Wirkungs-Modell sollte ich auswählen?

ELISA-Kits empfehlen im Allgemeinen ein 4PL-dose-response-Modell zum Anpassen von Standardkurven. Wenn alle Ihre OD-Werte für die Standardkurve innerhalb des linearen Antwortbereichs liegen, ist es ebenso zulässig, die Interpolation anhand eines linearen Modells mit einem ähnlichen Ablauf wie oben beschrieben durchzuführen.