如何拟合标准曲线并根据板数据插值未知样本

本指南介绍如何在 BioRender Graphing 中拟合 dose-response 标准曲线，并在标准品和未知样本位于同一数据列中时，使用该曲线对未知样本进行插值，这种情况常见于酶标仪导出数据。您还将绘制插值结果。

注意：Graphing agent 目前不支持标准曲线插值。要对未知样本进行插值，请按照本指南中的手动步骤操作。

第 1 步：上传数据

打开新的 Graphing 文件，然后点击 Choose a file (1)，或将文件拖入其中。支持的格式包括 .csv、.xlsx、.xls、.prism 和 .pzfx，文件大小上限为 50MB。

第 2 步：选择要导入的数据集

如果工作簿包含多个数据集，请勾选所需的数据集 (1)，然后点击 Import data (2)。

第 3 步：检查数据布局

此示例数据集类似于 BioRender Graphing 中提供的 ELISA 药物筛选示例数据，其排列方式是酶标仪输出的长格式数据。标准品在 conc_std 中具有已知浓度 (1)。未知样本在同一 value 列中仅有响应值，另带有处理标签 (2)。

第 4 步：为标准品的 OD 值创建变量

1. 在 Variables 面板中，点击 + 添加变量。例如，将其命名为 ODval_std 
2. 点击 Select cells。
3. 点击 "Save"。

第 5 步：选择标准品单元格

1. 拖动选中标准品的响应值单元格。 
2. 所选范围会显示在框中（本例中为 C2:C25）。
3. 点击 "Done"。
4. "Save"。

第 6 步：为未知孔的 OD 值创建变量

1. 添加第二个变量（例如 ODval_unk）。 
2. 选择未知样本的范围（例如 C26:C97）。
3. 点击 "Save"。

第 7 步：确认两个变量

ODval_std 和 ODval_unk 现在会显示在 "Variables" 面板中 (1)。

第 8 步：创建新图表

在 Graphs 下，点击 "Create new" (1)。

第 9 步：选择 Dose response curve

打开 Graph 类型列表，然后选择 "Dose response curve" (1)。

第 10 步：分配变量

1. 将 X 轴变量设置为浓度 conc_std。
2. 将 Y 轴变量设置为标准品的响应值 ODval_std。 
3. 然后点击 "Continue"。

第 11 步（可选）：使用对数 X 轴

1. 点击 x 轴
2. 将 "Axis scale" 设置为 Log10 
3. 或者，让 "Quick edit" 将底部坐标轴设置为以 10 为底的对数。

第 12 步：Run 新分析

在左侧面板中，点击 Run new analysis (1)。

第 13 步：选择 regression

1. 将 Analysis type 设置为 Nonlinear Regression，并将 Regression Type 设置为 "Dose-Response Regression"。 
2. 在 Dose response model 下，如果响应值随剂量升高而升高，请选择 "Stimulation"；如果响应值随剂量升高而降低，请选择 "Inhibition"。

第 14 步：显示插值选项

滚动到 Step 3 - Follow-up analyses，然后点击 Show interpolation options (1)。

第 15 步：选择未知样本

1. 打开 Values to interpolate。
2. 选择包含未知样本的变量。

第 16 步：选择方向并运行

1. 确认变量。 
2. 在 Interpolation direction 下，选择 Find X from Y，以根据响应值获得浓度。
3. 或者，选择 Find Y from X，以根据浓度预测响应值。 
4. 现在，"Follow-up analyses" 下的 Interpolation 已被勾选。
5. 点击 "Run analysis"。

第 17 步：查看拟合曲线

• 每项分析都会保存到 Reports (3) 下。  
• 在 Show analysis (1) 下，选择刚刚运行的 Dose-Response Regression，拟合曲线将显示在图表上。 
• 您还可以选择切换 Best-fit curve、95% Confidence interval 等选项 (2)。 

第 18 步：打开报告

1. 点击 Reports 下的 Dose Response Regression 报告。报告会列出最佳拟合值（EC50）、曲线系数（Top、Bottom、Hill slope）和拟合优度。 
2. 随后会显示未知样本的插值结果。

第 19 步：读取插值结果

1. Input 是测量值，Predicted 是插值结果，并会显示其 95% CI。 
2. “Within 2% of a plateau” 表示该结果的确定性较低。 
3. 如果显示 NA，并提示“No result can be calculated for this value”，表示输入值位于曲线的 Top 和 Bottom 之外 (3)。 
4. 点击 Add as new dataset，将此表作为数据集用于进一步分析。

第 20 步：打开新数据集

1. 数据视图底部会出现一个包含插值结果的新选项卡。您可以将原始数据中未知样本的处理标签复制并粘贴到此数据集的 Sample 标题下，以便为其添加相关标签。 
2. 然后点击 "Detect variables"，为每一列分配变量。

第 21 步：检查检测到的变量

Sample、Input、Predicted、95% CI 和 Notes 现在都是变量。

第 22 步：Graph 插值结果

创建新图表。 

1. 选择插值数据集。
2. 选择 Mean/median line 等图表类型。 
3. 将 X 轴变量设置为 Sample。
4. 将 Y 轴变量设置为 Predicted。
5. 点击 "Continue"。

第 23 步（可选）：排除不可靠的值

1. 要移除确定性较低的值（例如被标记为 within 2% of a plateau 的 192.19），请在 "Displayed" data 中右键点击该值。
2. 选择 "Exclude"。

第 24 步：检查更新后的图表

1. y 轴会重新缩放。
2. 该值会显示为灰色。

常见问题排查

结果显示 "NA"，并提示 "No result can be calculated for this value"

当输入值高于拟合曲线的 Top 或低于拟合曲线的 Bottom 时，就会出现这种情况。

例如，对于拟合 Top 为 2.04、Bottom 为 0.08 的曲线，2.1 或 0.02 的值都位于曲线范围之外。

解决方法：

• 检查测量值是否正确。
• 如有需要，请以适当的稀释倍数重新检测样本，使测量值落在标准曲线范围内。

结果显示 "Within 2% of a plateau"

接近标准曲线 Top 或 Bottom 的值可靠性较低，可能产生极端结果，或导致 95% 置信区间 (CI) 较宽或缺失。

解决方法：

• 如有可能，请使用落在标准曲线中部较陡部分的样本。
• 或者，从分析中排除受影响的值（请参阅第 23 步）。

未知样本变量未显示在 "Values to interpolate" 下

已分配给图表坐标轴的变量（例如 conc_std 和 ODval_std）不会显示在 "Values to interpolate" 列表中。

解决方法：

• 按照第 4 步至第 6 步，将未知样本创建为单独的变量。
• 返回 "Values to interpolate"，然后选择新创建的变量。

统计检验显示 "Category 'drug_2' has 1 samples, needs at least 2"

当某个组没有足够的有效结果来执行统计检验时，就会出现此错误。

例如，如果三个 drug_2 结果中有两个为 NA，则只剩下一个有效值。

解决方法：

• 检查该组中是否存在 NA 结果。
• 如果该组少于两个有效值，请在再次运行统计检验前，取消在 "Select categorical groups" 下对该组的选择。

常见问题

为什么要为标准品和未知样本创建单独的变量？

两者位于同一数据列中。单独的变量可以告诉 Graphing 哪些单元格用于拟合曲线，以及哪些单元格用于插值。

何时应使用 Find X from Y，而不是 Find Y from X？

使用 Find X from Y 可根据测量的响应值估算浓度。使用 Find Y from X 可根据已知浓度预测响应值。

应该选择哪种剂量-响应模型？

ELISA 试剂盒通常建议使用 4PL dose-response 模型拟合标准曲线。如果标准曲线的 OD 值都位于响应的线性范围内，则使用线性模型进行插值同样有效，操作流程与上述流程类似。