如何拟合标准曲线并根据板数据插值未知样本

本指南介绍如何在 BioRender Graphing 中拟合 dose-response 标准曲线，并使用该曲线对未知样本进行插值；适用于标准品和未知样本位于同一数据列中的情况，例如板式读取器导出的数据。您还将绘制插值后的数值。

分步指南

第 1 步：上传数据

打开一个新的 Graphing 文件，然后点击选择文件 (1)，或将文件拖入。支持的格式包括 .csv、.xlsx、.xls、.prism 和 .pzfx，文件大小上限为 50MB。

第 2 步：选择要导入的数据集

如果您的工作簿包含多个数据集，请勾选所需的数据集 (1)，然后点击导入数据 (2)。

第 3 步：检查数据布局

此示例数据集与 BioRender Graphing 中提供的 ELISA 药物筛选示例数据类似，其排列方式是板式读取器输出的长格式。标准品在 conc_std 中具有已知浓度 (1)。未知样本仅在同一个数值列中有响应值，并带有处理标签 (2)。

第 4 步：为标准品的 OD 值创建变量

1. 在“变量”面板中，点击 + 添加变量。为其命名，例如 ODval_std 
2. 点击选择单元格。
3. 点击 "Save"。

第 5 步：选择标准品单元格

1. 拖动选中标准品的响应值单元格。 
2. 该范围会显示在框中（本例中为 C2:C25）。
3. 点击 "Done"。
4. "Save"。

第 6 步：为未知孔的 OD 值创建变量

1. 添加第二个变量（例如 ODval_unk）。 
2. 指定未知样本的范围（例如 C26:C97）。
3. 点击 "Save"。

第 7 步：确认两个变量

ODval_std 和 ODval_unk 现在会显示在“变量”面板中 (1)。

第 8 步：创建新图表

在“图表”下，点击“创建新图表” (1)。

第 9 步：选择 Dose response curve

打开 Graph 类型列表，然后选择“Dose response curve” (1)。

第 10 步：分配变量

1. 将 X 轴变量设置为浓度 conc_std。
2. 将 Y 轴变量设置为标准品的响应值 ODval_std。 
3. 然后点击 "Continue"。

第 11 步（可选）：使用对数 X 轴

1. 点击 x 轴
2. 将“轴刻度”设置为 Log10 
3. 或者，让 "Quick edit" 将底部坐标轴设置为以 10 为底的对数。

第 12 步：Run 新分析

在左侧面板中，点击 Run 新分析 (1)。

第 13 步：选择 regression

1. 将分析类型设置为非线性回归，并将回归类型设置为“Dose-Response Regression”。 
2. 在剂量-反应模型下，如果响应值随剂量升高而升高，请选择“Stimulation”；如果响应值随剂量升高而降低，请选择“Inhibition”。

第 14 步：显示插值选项

滚动至第 3 步 - 后续分析，然后点击显示插值选项 (1)。

第 15 步：选择未知样本

1. 打开要插值的值。
2. 选择包含未知样本的变量。

第 16 步：选择方向并运行

1. 确认变量。 
2. 在插值方向下，选择从 Y 求 X，以根据响应值获取浓度。
3. 或者选择从 X 求 Y，以根据浓度预测响应值。 
4. “插值”现在会在“后续分析”下处于勾选状态。
5. 点击 "Run analysis"。

第 17 步：查看拟合曲线

• 每项分析都会保存在“报告”下 (3)。  
• 在“显示分析” (1) 下，选择刚刚运行的 Dose-Response Regression，拟合曲线将显示在图表上。 
• 您还可以选择性地切换显示最佳拟合曲线、95% 置信区间等 (2)。 

第 18 步：打开报告

1. 点击“报告”下的 Dose Response Regression 报告。该报告会列出最佳拟合值（EC50）、曲线系数（Top、Bottom、Hill slope）以及拟合优度。 
2. 随后会显示未知样本的插值结果。

第 19 步：读取插值结果

1. Input 是您测量得到的值，Predicted 是插值结果，并会显示其 95% CI。 
2. “Within 2% of a plateau”表示该结果的确定性较低。 
3. 如果显示 NA 及“No result can be calculated for this value”，表示输入值落在曲线的 Top 和 Bottom 之外 (3)。 
4. 点击添加为新数据集，将此表作为数据集用于进一步分析。

第 20 步：打开新数据集

1. 数据视图底部会出现一个包含插值结果的新选项卡。您可以将原始数据中未知样本的处理标签复制并粘贴到该数据集的 Sample 标题下，以便为其保留相关标签。 
2. 然后点击“检测变量”，为每一列分配变量。

第 21 步：检查检测到的变量

Sample、Input、Predicted、95% CI 和 Notes 现在都是变量。

第 22 步：Graph 插值结果

创建新图表。 

1. 选择插值后的数据集。
2. 选择一种图表类型，例如均值/中位数线。 
3. 将 X 轴变量设置为 Sample。
4. 将 Y 轴变量设置为 Predicted。
5. 点击 "Continue"。

第 23 步（可选）：排除不可靠的值

1. 要移除确定性较低的值，例如被标记为“within 2% of a plateau”的 192.19，请在“已显示”数据中右键点击该值。
2. 选择“排除”。

第 24 步：检查更新后的图表

1. Y 轴会重新缩放。
2. 该值会显示为灰色。

常见问题排查

结果显示“NA”，并附带消息“No result can be calculated for this value”

当输入值高于拟合的 Top 或低于标准曲线拟合的 Bottom 时，就会出现这种情况。

例如，对于拟合 Top 为 2.04、Bottom 为 0.08 的曲线，2.1 或 0.02 的值都落在曲线范围之外。

解决方法：

• 检查测量值是否正确。
• 如有需要，以能够产生标准曲线范围内测量值的稀释倍数重新检测样本。

结果显示“Within 2% of a plateau”

接近标准曲线 Top 或 Bottom 的值可靠性较低，可能产生极端结果，或导致 95% 置信区间 (CI) 较宽或缺失。

解决方法：

• 在可能的情况下，使用落在标准曲线较陡的中间部分内的样本。
• 或者，从分析中排除受影响的值（参见第 23 步）。

您的未知样本变量未显示在“要插值的值”下

已经分配给图表坐标轴的变量，例如 conc_std 和 ODval_std，不会显示在“要插值的值”列表中。

解决方法：

• 按照第 4 步至第 6 步，将未知样本创建为单独的变量。
• 返回“要插值的值”，然后选择新创建的变量。

统计检验显示“Category 'drug_2' has 1 samples, needs at least 2”

当某个组没有足够的有效结果来执行统计检验时，就会出现此错误。

例如，如果三个 drug_2 结果中有两个为 NA，则只剩下一个有效值。

解决方法：

• 检查该组中是否存在 NA 结果。
• 如果该组少于两个有效值，请在再次运行统计检验之前，在“选择分类组”下取消选择该组。

常见问题

为什么要为标准品和未知样本创建单独的变量？

两者位于同一个数值列中。单独的变量可以告知 Graphing 哪些单元格用于拟合曲线，以及哪些单元格用于插值。

什么时候应使用从 Y 求 X，什么时候应使用从 X 求 Y？

使用从 Y 求 X，根据测量到的响应值估算浓度。使用从 X 求 Y，根据已知浓度预测响应值。

应选择哪种剂量-反应模型？

ELISA 试剂盒通常建议使用 4PL dose-response 模型拟合标准曲线。如果标准曲线的 OD 值全部落在响应的线性范围内，则使用线性模型进行插值同样有效，工作流程与上述流程类似。