Come adattare una curva standard e interpolare i valori sconosciuti dai dati della piastra

Questa guida mostra come adattare una curva standard dose-response in BioRender Graphing e utilizzarla per interpolare campioni sconosciuti quando gli standard e i campioni sconosciuti si trovano nella stessa colonna di dati, come in un’esportazione da un lettore di piastre. Verranno inoltre rappresentati graficamente i valori interpolati.

Nota: L’agente Graphing attualmente non supporta l’interpolazione della curva standard. Per interpolare i campioni sconosciuti, segui i passaggi manuali descritti in questa guida.

Passaggio 1: carica i dati

Apri un nuovo file di Graphing e fai clic su Choose a file (1), oppure trascina il file nell’area. I formati supportati sono .csv, .xlsx, .xls, .prism e .pzfx, fino a 50 MB.

Passaggio 2: scegli il dataset da importare

Se la cartella di lavoro contiene diversi dataset, seleziona quello che ti serve (1) e fai clic su Import data (2).

Passaggio 3: controlla la struttura dei dati

Questo dataset di esempio è simile ai dati campione dello screening farmacologico ELISA disponibili in BioRender Graphing ed è organizzato come un output in formato lungo proveniente da un lettore di piastre. Gli standard hanno una concentrazione nota in conc_std (1). I campioni sconosciuti hanno solo una risposta nella stessa colonna dei valori, oltre a un’etichetta del trattamento (2).

Passaggio 4: crea una variabile per i valori OD degli standard

1. Nel pannello Variables, fai clic su + per aggiungere una variabile. Assegnale, ad esempio, il nome ODval_std 
2. Fai clic su Select cells.
3. Fai clic su "Save".

Passaggio 5: seleziona le celle degli standard

1. Trascina sulle celle delle risposte degli standard. 
2. L’intervallo appare nella casella (in questo esempio, C2:C25).
3. Fai clic su "Done".
4. "Save".

Passaggio 6: crea una variabile per i valori OD dei pozzetti sconosciuti

1. Aggiungi una seconda variabile (ad esempio ODval_unk). 
2. Seleziona l’intervallo dei campioni sconosciuti (ad esempio, C26:C97).
3. Fai clic su "Save".

Passaggio 7: conferma entrambe le variabili

ODval_std e ODval_unk ora vengono visualizzate nel pannello "Variables" (1).

Passaggio 8: crea un nuovo grafico

In Graphs, fai clic su "Create new" (1).

Passaggio 9: scegli Dose response curve

Apri l’elenco dei tipi di Graph e seleziona "Dose response curve" (1).

Passaggio 10: assegna le variabili

1. Imposta la variabile dell’asse X sulla concentrazione, conc_std.
2. Imposta la variabile dell’asse Y sulla risposta degli standard, ODval_std. 
3. Quindi fai clic su "Continue".

Passaggio 11 (facoltativo): usa un asse X logaritmico

1. Fai clic sull’asse x
2. Imposta "Axis scale" su Log10 
3. In alternativa, chiedi a "Quick edit" di impostare l’asse inferiore sul logaritmo in base 10.

Passaggio 12: Run una nuova analisi

Nel pannello a sinistra, fai clic su Run new analysis (1).

Passaggio 13: scegli la regression

1. Imposta Analysis type su Nonlinear Regression e Regression Type su "Dose-Response Regression". 
2. In Dose response model, scegli "Stimulation" se la risposta aumenta con la dose, oppure "Inhibition" se diminuisce.

Passaggio 14: visualizza le opzioni di interpolazione

Scorri fino a Step 3 - Follow-up analyses e fai clic su Show interpolation options (1).

Passaggio 15: seleziona i campioni sconosciuti

1. Apri Values to interpolate.
2. Seleziona la variabile che contiene i campioni sconosciuti.

Passaggio 16: scegli la direzione ed esegui l’analisi

1. Conferma la variabile. 
2. In Interpolation direction, scegli Find X from Y per ottenere le concentrazioni dalle risposte.
3. In alternativa, scegli Find Y from X per prevedere le risposte dalle concentrazioni. 
4. Interpolation è ora selezionato in "Follow-up analyses".
5. Fai clic su "Run analysis".

Passaggio 17: visualizza la curva adattata

• Ogni analisi viene salvata in Reports (3).  
• In Show analysis (1), seleziona la Dose-Response Regression appena eseguita: la curva adattata apparirà sul grafico. 
• Se vuoi, attiva Best-fit curve, 95% Confidence interval, ecc. (2). 

Passaggio 18: apri il report

1. Fai clic sul report Dose Response Regression in Reports. Riporta i valori del miglior adattamento (EC50), i coefficienti della curva (Top, Bottom, Hill slope) e la bontà dell’adattamento. 
2. Seguono i valori interpolati per i campioni sconosciuti.

Passaggio 19: leggi i valori interpolati

1. Input è il valore misurato e Predicted è il valore interpolato, mostrato con il relativo IC del 95%. 
2. “Within 2% of a plateau” significa che il risultato è scarsamente determinato. 
3. NA con “No result can be calculated for this value” significa che l’input non rientra nei valori Top e Bottom della curva (3). 
4. Fai clic su Add as new dataset per trattare questa tabella come un dataset per ulteriori analisi.

Passaggio 20: apri il nuovo dataset

1. Nella parte inferiore della vista dei dati appare una nuova scheda con i valori interpolati. Puoi copiare e incollare le etichette dei trattamenti dei campioni sconosciuti dai dati originali in questo dataset, nella sezione Sample, in modo che mantengano le etichette pertinenti. 
2. Quindi fai clic su "Detect variables" per assegnare le variabili a ciascuna colonna.

Passaggio 21: controlla le variabili rilevate

Sample, Input, Predicted, 95% CI e Notes sono ora variabili.

Passaggio 22: Graph i valori interpolati

Crea un nuovo grafico. 

1. Seleziona il dataset interpolato.
2. Seleziona un tipo di grafico, ad esempio Mean/median line. 
3. Imposta la variabile dell’asse X su Sample.
4. Imposta la variabile dell’asse Y su Predicted.
5. Fai clic su "Continue".

Passaggio 23 (facoltativo): escludi un valore non affidabile

1. Per rimuovere un valore scarsamente determinato, come 192.19, contrassegnato come entro il 2% di un plateau, fai clic con il pulsante destro del mouse sul valore in "Displayed" data.
2. Scegli "Exclude".

Passaggio 24: controlla il grafico aggiornato

1. L’asse y viene ridimensionato.
2. Il valore viene visualizzato in grigio.

Risoluzione dei problemi comuni

Il risultato mostra "NA" con il messaggio "No result can be calculated for this value"

Questo accade quando il valore di input è superiore al valore Top adattato o inferiore al valore Bottom adattato della curva standard.

Ad esempio, i valori 2.1 o 0.02 non rientrano in una curva con un valore Top adattato di 2.04 e un valore Bottom di 0.08.

Per risolvere il problema:

• Verifica che le misurazioni siano corrette.
• Se necessario, ripeti l’analisi del campione con una diluizione che produca una misurazione compresa nell’intervallo della curva standard.

Il risultato mostra "Within 2% of a plateau"

I valori vicini al valore Top o Bottom della curva standard sono meno affidabili e possono produrre risultati estremi o un intervallo di confidenza (CI) del 95% ampio o mancante.

Per risolvere il problema:

• Quando possibile, usa campioni che rientrano nella porzione centrale più ripida della curva standard.
• In alternativa, escludi il valore interessato dall’analisi (vedi il Passaggio 23).

La variabile dei campioni sconosciuti non viene visualizzata in "Values to interpolate"

Le variabili già assegnate agli assi del grafico, come conc_std e ODval_std, non vengono visualizzate nell’elenco "Values to interpolate".

Per risolvere il problema:

• Crea i campioni sconosciuti come variabile separata seguendo i Passaggi da 4 a 6.
• Torna a "Values to interpolate" e seleziona la variabile appena creata.

Un test statistico mostra "Category 'drug_2' has 1 samples, needs at least 2"

Questo errore si verifica quando un gruppo non dispone di un numero sufficiente di risultati validi per eseguire il test statistico.

Ad esempio, se due dei tre risultati drug_2 sono NA, rimane un solo valore valido.

Per risolvere il problema:

• Controlla il gruppo per individuare i risultati NA.
• Se il gruppo contiene meno di due valori validi, deselezionalo in "Select categorical groups" prima di eseguire nuovamente il test statistico.

Domande frequenti

Perché creare variabili separate per standard e campioni sconosciuti?

Entrambi si trovano nella stessa colonna dei valori. Le variabili separate indicano a Graphing quali celle utilizzare per adattare la curva e quali celle interpolare.

Quando devo usare Find X from Y invece di Find Y from X?

Usa Find X from Y per stimare una concentrazione a partire da una risposta misurata. Usa Find Y from X per prevedere una risposta a partire da una concentrazione nota.

Quale modello dose risposta devo scegliere?

I kit ELISA generalmente consigliano un modello 4PL dose-response per adattare le curve standard.  Se tutti i valori OD della curva standard rientrano nell’intervallo lineare della risposta, sarebbe altrettanto valido interpolare da un modello lineare utilizzando un flusso di lavoro simile a quello descritto sopra.