Come adattare una curva standard e interpolare gli sconosciuti dai dati della piastra

Questa guida mostra come adattare una curva standard dose-response in BioRender Graphing e usarla per interpolare campioni sconosciuti quando gli standard e gli sconosciuti si trovano nella stessa colonna di dati, come in un’esportazione da un lettore di piastre. Verranno inoltre rappresentati graficamente i valori interpolati.

Guida passo passo

Passaggio 1: carica i dati

Apri un nuovo file di Graphing e fai clic su Scegli un file (1), oppure trascina il file nell’area. I formati supportati sono .csv, .xlsx, .xls, .prism e .pzfx, fino a 50 MB.

Passaggio 2: scegli il dataset da importare

Se la cartella di lavoro contiene diversi dataset, seleziona quello che ti serve (1) e fai clic su Importa dati (2).

Passaggio 3: controlla la disposizione dei dati

Questo dataset di esempio è simile ai dati di esempio dello screening farmacologico ELISA disponibili in BioRender Graphing ed è organizzato come un output in formato lungo proveniente da un lettore di piastre. Gli standard hanno una concentrazione nota in conc_std (1). Gli sconosciuti hanno solo una risposta nella stessa colonna dei valori, oltre a un’etichetta del trattamento (2).

Passaggio 4: crea una variabile per i valori OD degli standard

1. Nel pannello Variabili, fai clic su + per aggiungere una variabile. Assegnale, ad esempio, il nome ODval_std 
2. Fai clic su Seleziona celle.
3. Fai clic su "Save".

Passaggio 5: seleziona le celle degli standard

1. Trascina sulle celle delle risposte degli standard. 
2. L’intervallo viene visualizzato nella casella (in questo esempio, C2:C25).
3. Fai clic su "Done".
4. "Save".

Passaggio 6: crea una variabile per i valori OD dei pozzetti sconosciuti

1. Aggiungi una seconda variabile (ad esempio ODval_unk). 
2. Con l’intervallo degli sconosciuti (nell’esempio, C26:C97).
3. Fai clic su "Save".

Passaggio 7: conferma entrambe le variabili

ODval_std e ODval_unk ora vengono visualizzate nel pannello "Variabili" (1).

Passaggio 8: crea un nuovo grafico

In Grafici, fai clic su "Crea nuovo" (1).

Passaggio 9: scegli Curva dose-risposta

Apri l’elenco dei tipi di Graph e seleziona "Dose response curve" (1).

Passaggio 10: assegna le variabili

1. Imposta la variabile dell’asse X sulla concentrazione, conc_std.
2. Imposta la variabile dell’asse Y sulla risposta degli standard, ODval_std. 
3. Quindi fai clic su "Continue".

Passaggio 11 (facoltativo): usa un asse X logaritmico

1. Fai clic sull’asse x
2. Imposta "Scala dell’asse" su Log10 
3. In alternativa, chiedi a "Quick edit" di impostare l’asse inferiore sulla scala logaritmica in base 10.

Passaggio 12: Run una nuova analisi

Nel pannello a sinistra, fai clic su Run new analysis (1).

Passaggio 13: scegli la regression

1. Imposta Tipo di analisi su Regressione non lineare e Tipo di regressione su "Dose-Response Regression". 
2. In Modello dose-risposta, scegli "Stimulation" se la risposta aumenta con la dose, oppure "Inhibition" se diminuisce.

Passaggio 14: visualizza le opzioni di interpolazione

Scorri fino a Passaggio 3 - Analisi di follow-up e fai clic su Mostra opzioni di interpolazione (1).

Passaggio 15: seleziona gli sconosciuti

1. Apri Valori da interpolare.
2. Scegli la variabile che contiene gli sconosciuti.

Passaggio 16: scegli la direzione ed esegui

1. Conferma la variabile. 
2. In Direzione dell’interpolazione, scegli Find X from Y per ottenere le concentrazioni dalle risposte.
3. In alternativa, scegli Find Y from X per prevedere le risposte dalle concentrazioni. 
4. L’interpolazione è ora selezionata in "Analisi di follow-up".
5. Fai clic su "Run analysis".

Passaggio 17: visualizza la curva adattata

• Ogni analisi viene salvata in Report (3).  
• In Mostra analisi (1), seleziona la Dose-Response Regression appena eseguita: la curva adattata apparirà sul grafico. 
• Facoltativamente, attiva Curva di miglior adattamento, Intervallo di confidenza del 95% ecc. (2). 

Passaggio 18: apri il report

1. Fai clic sul report Dose Response Regression in Report. Riporta i valori del miglior adattamento (EC50), i coefficienti della curva (Top, Bottom, pendenza di Hill) e la bontà dell’adattamento. 
2. Seguono i valori interpolati per gli sconosciuti.

Passaggio 19: leggi i valori interpolati

1. Input è il valore misurato, mentre Predicted è il valore interpolato, mostrato con il relativo IC del 95%. 
2. “Entro il 2% di un plateau” significa che il risultato è determinato in modo poco affidabile. 
3. NA con “Non è possibile calcolare alcun risultato per questo valore” significa che l’input si trova al di fuori dei valori Top e Bottom della curva (3). 
4. Fai clic su Aggiungi come nuovo dataset per trattare questa tabella come un dataset da sottoporre a ulteriori analisi.

Passaggio 20: apri il nuovo dataset

1. Una nuova scheda con i valori interpolati appare nella parte inferiore della vista dati. Puoi copiare e incollare in questo dataset, sotto l’intestazione Sample, le etichette dei trattamenti degli sconosciuti dai dati originali, in modo che riportino le etichette pertinenti. 
2. Quindi fai clic su "Rileva variabili" per assegnare le variabili a ciascuna colonna.

Passaggio 21: controlla le variabili rilevate

Sample, Input, Predicted, 95% CI e Notes sono ora variabili.

Passaggio 22: Graph i valori interpolati

Crea un nuovo grafico. 

1. Seleziona il dataset interpolato.
2. Seleziona un tipo di grafico come Linea della media/mediana. 
3. Imposta la variabile dell’asse X su Sample.
4. Imposta la variabile dell’asse Y su Predicted.
5. Fai clic su "Continue".

Passaggio 23 (facoltativo): escludi un valore non affidabile

1. Per rimuovere un valore determinato in modo poco affidabile, come 192.19 contrassegnato come entro il 2% di un plateau, fai clic con il pulsante destro del mouse su di esso nei dati "Visualizzati".
2. Scegli "Escludi".

Passaggio 24: controlla il grafico aggiornato

1. L’asse y viene ridimensionato.
2. Il valore viene visualizzato in grigio.

Risoluzione dei problemi comuni

Il risultato visualizza "NA" con il messaggio "Non è possibile calcolare alcun risultato per questo valore"

Ciò si verifica quando il valore di input è superiore al valore Top adattato o inferiore al valore Bottom adattato della curva standard.

Ad esempio, i valori 2.1 o 0.02 si trovano al di fuori di una curva con un valore Top adattato di 2.04 e un valore Bottom di 0.08.

Per risolvere il problema:

• Controlla che le misurazioni siano corrette.
• Se necessario, ripeti l’analisi del campione con una diluizione che produca una misurazione all’interno dell’intervallo della curva standard.

Il risultato visualizza "Entro il 2% di un plateau"

I valori vicini al valore Top o Bottom della curva standard sono meno affidabili e possono produrre risultati estremi oppure un intervallo di confidenza (CI) del 95% ampio o mancante.

Per risolvere il problema:

• Quando possibile, usa campioni che rientrano nella porzione centrale, più ripida, della curva standard.
• In alternativa, escludi dall’analisi il valore interessato (vedi Passaggio 23).

La variabile degli sconosciuti non viene visualizzata in "Valori da interpolare"

Le variabili già assegnate agli assi del grafico, come conc_std e ODval_std, non vengono visualizzate nell’elenco "Valori da interpolare".

Per risolvere il problema:

• Crea gli sconosciuti come variabile separata seguendo i Passaggi da 4 a 6.
• Torna a "Valori da interpolare" e seleziona la variabile appena creata.

Un test statistico visualizza "La categoria 'drug_2' ha 1 campione, ne servono almeno 2"

Questo errore si verifica quando un gruppo non dispone di risultati validi sufficienti per eseguire il test statistico.

Ad esempio, se due dei tre risultati drug_2 sono NA, rimane un solo valore valido.

Per risolvere il problema:

• Controlla il gruppo per verificare la presenza di risultati NA.
• Se il gruppo contiene meno di due valori validi, deselezionalo in "Seleziona gruppi categorici" prima di eseguire nuovamente il test statistico.

Domande frequenti

Perché creare variabili separate per standard e sconosciuti?

Entrambi si trovano nella stessa colonna dei valori. Le variabili separate indicano a Graphing quali celle usare per adattare la curva e quali celle interpolare.

Quando devo usare Find X from Y invece di Find Y from X?

Usa Find X from Y per stimare una concentrazione a partire da una risposta misurata. Usa Find Y from X per prevedere una risposta a partire da una concentrazione nota.

Quale modello dose-risposta devo scegliere?

I kit ELISA generalmente consigliano un modello 4PL dose-response per adattare le curve standard.  Se tutti i valori OD della curva standard rientrano nell’intervallo lineare della risposta, sarebbe altrettanto valido interpolare da un modello lineare usando un flusso di lavoro simile a quello descritto sopra.